产品货号：
KL260114
中文名称：
RNA结合蛋白免疫沉淀试剂盒
英文名称：
RNA Binding Protein Immunoprecipitation Kit
产品规格：
6T
发货周期：
1～3天
产品价格：
询价
简要说明：
产品组成：
保存：-20℃，有效期1年。
用户自备：
去离子水、BCA蛋白浓度测定试剂盒、0.22mm注射器式滤膜
使用方法：
相关搜索：RNA结合蛋白免疫沉淀试剂盒，RIP试剂盒，RNA Binding Protein Immunoprecipitation Kit
RIP技术（RNA Binding Protein Immunoprecipitation）是研究细胞内RNA与蛋白结合情况的技术，是了解转录后调控网络动态过程的有力工具。该技术主要是运用目标蛋白的特异性抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来，然后经过分离纯化对结合在复合物上的RNA进行qPCR验证或者高通量测序分析。
产品组成：
| 组分 | 规格 |
| RIP裂解缓冲液 | 2.4mL |
| 100×蛋白酶抑制剂 | 15μL |
| RNA酶抑制剂 | 35μL |
| 蛋白A/G磁珠 | 200μL |
| 1mg/mL正常兔IgG | 30μL |
| 1mg/mL正常鼠IgG | 30μL |
| RIP洗涤缓冲液 | 50μL |
| 0.5M EDTA | 400μL |
| 盐溶液 | 600μL |
| DEPC水 | 400μL |
| 洗脱缓冲液 | 800μL |
保存：-20℃，有效期1年。
用户自备：
去离子水、BCA蛋白浓度测定试剂盒、0.22mm注射器式滤膜
使用方法：
- 样本前处理
- 准备405μL完全RIP裂解缓冲液(400μL RIP裂解缓冲液+4μL 100×蛋白酶抑制剂+1μL RNA酶抑制剂)
- 动物细胞：
- 收集2×107个细胞样品，加入2mL PBS洗涤细胞，离心后弃上清收集细胞沉淀，预留1/4的细胞样品用于后续input组的RNA提取及纯化。
- 向剩余细胞沉淀中加入400μL完全RIP裂解缓冲液重悬，并用移液枪吹打混匀10次，使细胞充分裂解，冰浴30min，每10min涡旋一次，10s/次，4℃ 12000rpm离心10min，取上清，记为裂解产物，并按照150μL(IP)、150μL(IgG)、100μL(input)分成三份，input样本-80℃保存备用。
- 收集2×107个细胞样品，加入2mL PBS洗涤细胞，离心后弃上清收集细胞沉淀，预留1/4的细胞样品用于后续input组的RNA提取及纯化。
- 动物组织：
- 取新鲜组织或低温组织(约0.3g)，置于预冷的研钵中，加入液氮进行快速研磨至粉末状，并收集到2管无RNase的离心管中，1管约1/4的组织样品预留用于后续input组的RNA提取及纯化。
- 向另一管组织粉末中加入400μL完全RIP裂解缓冲液重悬沉淀，用移液枪吹打混匀10次，使组织充分裂解，冰浴30min，每10min涡旋一次，10s/次，4℃ 12000rpm离心10min，取上清，记为裂解产物，并按照150μL(IP)、150μL(IgG)、100μL(input)分成三份，input样品-80℃保存备用。
- 取新鲜组织或低温组织(约0.3g)，置于预冷的研钵中，加入液氮进行快速研磨至粉末状，并收集到2管无RNase的离心管中，1管约1/4的组织样品预留用于后续input组的RNA提取及纯化。
- 磁珠准备
- 准备2支1.5mL EP管，分别标记IgG管和IP管，将蛋白A/G磁珠原管上下颠倒10次，待磁珠和液体混匀后，分别取出30μL到IgG管和IP管。
- 每管加入300μL RIP洗涤缓冲液，用移液枪吹打混匀5次，置于磁力架上静置1min，弃上清，该步骤操作3次。
- 用300μL的RIP洗涤缓冲液重悬磁珠。
- 准备2支1.5mL EP管，分别标记IgG管和IP管，将蛋白A/G磁珠原管上下颠倒10次，待磁珠和液体混匀后，分别取出30μL到IgG管和IP管。
- 磁珠结合抗体
- IP管加入3～5μg目的抗体，IgG管加入3～5μg目的抗体相同宿主的IgG，放到静音混合器上室温孵育60min。
- 将两管放到磁力架上静置1min，弃上清。加入300μL RIP洗涤缓冲液，用移液枪吹打混匀5次，在磁力架上静置1min，弃上清，该步骤操作3次。
- IP管加入3～5μg目的抗体，IgG管加入3～5μg目的抗体相同宿主的IgG，放到静音混合器上室温孵育60min。
- RNA结合蛋白免疫沉淀
- 准备1.8mL RIP缓冲液（1720μL RIP洗涤缓冲液+70μL 0.5M EDTA+10μL RNA酶抑制剂）；向步骤C所得的IgG管和IP管中分别加入900μL RIP缓冲液，150μL步骤A所得裂解产物，放到静音混合器上，4℃孵育过夜。
- 将两管放到磁力架上静置1min，弃上清；将两管各加入300μL RIP洗涤缓冲液，用移液枪吹打混匀5次，在磁力架上静置1min，弃上清，该步骤操作5次。
- 将两管各加入300μL RIP洗涤缓冲液，用移液枪吹打混匀5次，取100μL混合液到新管，标记为A管，剩余液体记为B管，将4管置于磁力架上静置1min，弃上清，A管加100μL洗脱缓冲液，煮沸10min后磁力架上静置1min，取上清到新管，加入10μL 6×上样缓冲液混匀准备WB检测，B管用于纯化RNA，分组设置见下表：
实验组 RIP洗涤缓冲液 样本名称 体积 实验 lgG 300μL lgG-A 100μL WB检测 lgG-B 200μL RNA纯化 IP 300μL IP-A 100μL RNA纯化 IP-B 200μL RNA纯化
- 准备1.8mL RIP缓冲液（1720μL RIP洗涤缓冲液+70μL 0.5M EDTA+10μL RNA酶抑制剂）；向步骤C所得的IgG管和IP管中分别加入900μL RIP缓冲液，150μL步骤A所得裂解产物，放到静音混合器上，4℃孵育过夜。
- RNA纯化
- 步骤A预留的input样品和步骤D的IgG-B管与IP-B管中各加入500μL的TrizoL，涡旋混匀，室温静置5min，再加入100μL的氯仿，涡旋混匀，4℃ 14000rpm离心10min，取上层水相（约300μL）到新管，做好标记。
- 加入50μL盐溶液，550μL异丙醇混匀，-80℃静置2～4h（亦可静置过夜），使用前放置4℃解冻。
- 4℃ 14000rpm离心10min，弃上清，加入500μL 75%乙醇，4℃ 14000rpm离心10min，小心弃掉上清，该步操作3次。
- 开盖室温晾干，加10～20μL DEPC水，移液枪吹打，使RNA完全溶解，-80℃保存备用。
- 步骤A预留的input样品和步骤D的IgG-B管与IP-B管中各加入500μL的TrizoL，涡旋混匀，室温静置5min，再加入100μL的氯仿，涡旋混匀，4℃ 14000rpm离心10min，取上层水相（约300μL）到新管，做好标记。
- RIP-qPCR（选作步骤）
- 逆转录：按照逆转录试剂盒进行操作。
- 反应程序：将Input、IP、IgG逆转录后cDNA分别取1μL加入到PCR反应孔中，每个样品三复孔，其余组分按照SYBR Green qPCR Mix说明书进行添加，加完后做好标记瞬时离心10 s，放入荧光定量PCR仪中上机检测。详细点样方式如下(阳性样本只做GAPDH引物确认是否富集即可)：
1 2 3 4 5 6 7 8 9 引物1 B input input input IgG IgG IgG IP IP IP 引物2 C input input input IgG IgG IgG IP IP IP ... ... input input input IgG IgG IgG IP IP IP - 结果计算：Fold Enrichment=2^(△△Ct)（以lgG为参照)
△△Ct=(Ct Ip-Ct input)-(Ct lgc-Ct input)=×(input组目标基因Ct input值作为参照Ct值）则目标基因的IP组表达水平为lgG组的2的负x次方倍。
- 逆转录：按照逆转录试剂盒进行操作。
相关搜索：RNA结合蛋白免疫沉淀试剂盒，RIP试剂盒，RNA Binding Protein Immunoprecipitation Kit